TERPENOID: Penentuan Struktur Senyawa Terpenoid

Keterkaitan antara biosintesis, metode isolasi, dan penentuan stuktur senyawa bahan alam sangatlah erat. Dapat dikatakan ketiga proses tersebut terjadi secara berurutan. Suatu senyawa bahan alam terlebih dahulu di sintesis agar diketahui proses/ reaksi kimia yang terjadi dalam memperoleh senyawa kimia yang diinginkan. Setelah itu diisolasi dengan metode tertentu agar dapat dipisahkan dari senyawa lain yang terkandung di dalamnya. Dengan melakukan isolasi suatu senyawa, maka kita dapat menentukan struktur dari senyawa tersebut.
Contoh:
Isolasi serbuk kering kulit batang tumbuhan kecapi (2,5 kg) menggunakan metoda maserasi dengan pelarut heksan pada suhu kamar selama 4 x 72 jam, kemudian ekstrak heksan yang diperoleh dilakukan evaporasi memakai penguap vakum (rotary evaporator) diperoleh ekstrak kering heksan sebanyak 38 g. Selanjutnya ampas direndam kembali dengan pelarut etil asetat pada suhu kamar selama 4 x 72 jam, kemudian ekstrak etil asetat yang diperoleh dilakukan evaporasi dan diperoleh ekstrak kering etil asetat sebanyak 102 g.
Hasil pemurnian 15 g ekstrak etil asetat dengan metoda kromatografi kolom gravitasi dan pengelusian dilakukan secara bergradien menggunakan pelarut heksan, etil asetat dan metanol diperoleh 485 vial/10 mL. Selanjutnya setelah vial dikeringkan, pada dinding vial nomor 57 terbentuk kristal berwarna putih kekuningan. Kemudian vial nomor 57 dianalisis dengan KLT dan terdapat noda tunggal. Kemudian dilanjutkan dengan pencucian dengan heksan diperoleh kristal murni berwarna putih berbentuk jarum sebanyak 32 mg.
Sebelum dilakukan elusidasi struktur senyawa hasil isolasi dengan spektroskopi terlebih dahulu dilakukan identifikasi dengan menggunakan pereaksi Liebermann-burchard, hasil identifikasi terbentuk bercak warna merah, hal ini menunjukkan bahwa senyawa hasil isolasi merupakan senyawa golongan triterpenoid. 

Pengukuran titik leleh senyawa hasil isolasi adalah 224 -226 oC , dengan range titik leleh 2 oC mengindikasikan bahwa senyawa hasil isolasi relatif murni. 
Senyawa golongan triterpenoid jarang yang dianalisis dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis disebabkan karena strukturnya yang tidak menyerap sinar UV-Vis (Kristanti dkk, 2008). Gambar spektrum ultra violet senyawa hasil isolasi menunjukkan, lmax (log e, nm ): 203 nm. Dari data tersebut menunjukan bahwa senyawa hasil isolasi adalah golongan triterpenoid.
Spektrum IR memperlihatkan pita serapan yang melebar pada bilangan gelombang, u max      : 3453 cm-1 , mengindikasikan adanya gugus hidroksil, pita serapan pada bilangan gelombang, u   max     : 2930 cm-1, merupakan serapan dari C-H alifatik, pita serapan pada bilangan gelombang, u max : 1691 cm-1, merupakan serapan dari C=O dari asam karboksilat yang diperkuat dengan adanya pita serapan pada bilangan gelombang, u m ax : 1114 cm-1, pita serapan pada bilangan gelombang, u   max   : 1454 cm-1 CH2 dan pita serapan pada bilangan gelombang, u max : 1384 cm-1 merupakan serapan dari C-H tekuk dari geminal dimetil yang merupakan ciri khas senyawa triterpenoid yang mendukung data spektroskopi ultra violet. 

 
Penentuan struktur terutama dilakukan dengan metoda spektroskopik dan difraksi.
·           Spektroskopi IR
Spektrofotometri inframerah  digunakan untuk identifikasi suatu senyawa melalui gugus fungsinya. Untuk keperluan elusidasi struktur, daerah dengan bilangan gelombang 1400 – 4000 cm^-1 yang berada dibagian kiri spektrum IR, merupakan daerah yang khusus berguna untuk identifikasi gugus-gugus fungsional, yang merupakan absorbsi dari vibrasi ulur. Selanjutnya daerah yang berada disebelah kanan bilangan  gelombang 1400 cm^-1 sering kali sangat rumit karena pada daerah ini terjadi absorbsi dari vibrasi ulur dan vibrasi tekuk, namun setiap senyawa organik memiliki absorbsi yang kharakteristik pada daerah ini. Oleh karena itu bagian spektrum  ini disebut daerah sidikjari (fingerprint region). Saat ini ada dua macam instrumen yaitu spektroskopi IR dan FTIR (Furier Transformation Infra Red). FTIR lebih sensitif dan akurat misalkan dapat membedakan bentuk cis dan trans, ikatan rangkap terkonyugasi dan terisolasi dan lain-lain yang dalam spektrofotometer IR tidak dapat dibedakan.
·           Spektroskopi UV
spektroskopi ultra violet memiliki kemampuan untuk mengukur jumlah ikatan rangkap atau konyugasi aromatik didalam suatu molekul. Daerah panjang gelombang dari spektrum ultra violet berkisar 200 - 400 nm. Penyerapan sinar ultra violet oleh suatu molekul akan menghasilkan transisi diantara tingkat energi elektronik molekul tersebut. Transisi tersebut terjadi pada orbital ikatan atau pasangan elektron bebas dengan orbital anti ikatan.


·           Spektroskpi NMR
Spektroskopi NMR memberikan gambaran mengenai atom-atom hidrogen dalam sebuah molekul. Spektroskopi NMR merupakan suatu metode Spektroskopi yang didasarkan pada penyerapan gelombang radio oleh inti-inti dalam molekul organik bila berada dalam medan magnet yang kuat.


·           Spektroskopi massa
Spektometer massa adalah suatu instrumen yang dapat menyeleksi molekul-molekul gas bermuatan berdasarkan massa atau beratnya. Teknik ini tidak dapat dilakukan dengan spektroskopi, akan tetapi nama spektroskopi dipilih disebabkan persamaannya dengan pencatat fotografi dan spektrum garis optik. Umumnya spektrum massa diperoleh dengan mengubah senyawa suatu sampel menjadi ion-ion yang bergerak cepat yang dipisahkan berdasarkan perbandingan massa terhadap muatan.
Proses ionisasi menghasilkan partikel-partikel bermuatan positif, dimana massa terdistribusi adalah spesifik terhadap senyawa induk. Selain untuk penentuan stuktur molekul, spektum massa dipakai untuk penentuan analisis kuantitatif.
Ada beberapa cara lain dalam penentuan struktur senyawa organik :
a. Uji titik leleh campuran
Metoda ini didasarkan prinsip bahwa titik leleh padatan paling tinggi ketika padatan itu murni. Bila dua sampel A dan B memiliki titik leleh yang sama, maka ditentukan titik leleh A murni, B murni dan campuran sejumlah sama A dan B. Bila hasil ketiganya sama, terbukti bahwa A dan B identik.
b. Penggunaan turunan padatan
Bila sampelnya berwujud cairan atau gas, metoda titik leleh campuran tidak dapat digunakan. Bila sampel gas atau cairan memiliki gugus fungsi yang reaktif, sampel ini dapat diubah menjadi padatan yang mungkin menghasilkan kristal yang indah. 

c. Perbandingan sifat fisik

Sifat fisik lain seperti titik didih, indeks bias, momen dipol, dan rotasi spesifik untuk senyawa yang optik aktif dapat memberikan onformasi yang bermanfaat. Data semacam ini dapat memberikan informasi pda sifat keseluruhan molekul. Kadang, sifat molekul keseluruhan dapat merupakan jumlah dari berbagai kontribusi bagian-bagian senyawa.
d. Reaksi kualitatif
Penentuan struktur senyawa organik meliputi dua pendekatan. informasi struktur secara kasar didapat dengan penentuan massa molekul, analisis unsur. informasi tentang molekul secaraa keseluruhan dan substituennya didapatkan secara seiring.
Contoh khasnya adalah deteksi gugus karbonil (aldehida -CHO dan keton -C=O) dengan menggunakan reaksi cermin perak dan uji Fehling. 
 
PERMASALAHAN:
Pada artikel diatas dikatakan bahwa penentuan struktur senyawa triterpenoid dalam kulit batang tanaman kecapi tidak dapat ditentukan dengan analisis spektroskopi UV-Vis karena tidak dapat menyerap sinar UV-Vis. Jadi, apa yang menjadi dasar dari penentuan struktur triterpenoid dari kulit batang tanaman kecapi ini serta analisis apa yang digunakan?

Permasalahan lanjutan, dari beberapa metode analisis untuk penentuan struktur senyawa bahan alam, yang dalam artikel ini berupa senyawa triterpenoid dikatakan masing-masing analisis itu memiliki kemampuan yang berbeda-beda. Misalnya pada spektroskopi IR yang diidentifikasi adalah gugus fungsinya, pada spektroskopi yang diidentifikasi adalah ikatan rangkap. Jadi, bagaimanakah kekhasan signal dan intensitas serapan dari senyawa golongan triterpenoid dengan metode analisis yang digunakan?