TERPENOID: ISolasi Senyawa Turunan TERPENOID dari Fraksi n-Heksan (Momordica charantia)

I.       PENDAHULUAN

Dalam tumbuhan biasanya terdapat senyawa hidrokarbon dan hidrokarbon teroksigenasi yang merupakan senyawa terpenoid. Kata terpenoid mencakup sejumlah besar senyawa tumbuhan, dan istilah ini digunakan untuk menunjukkan bahwa secara biosintesis semua senyawa tumbuhan itu berasal dari senyawa yang sama. Jadi, semua terpenoid berasal dari molekul isoprene CH₂==C(CH₃)─CH==CH₂ dan kerangka karbonnya dibangun oleh penyambungan 2 atau lebih satuan C5 ini. Kemudian senyawa itu dipilah-pilah menjadi beberapa golongan berdasarkan jumlah satuan yang terdapat dalam senyawa tersebut, 2 (C10), 3 (C15), 4 (C20), 6 (C30) atau 8 (C40).

Momordica charantia banyak digunakan sebagai obat diberbagai negara berkembang seperti, Brasil, Cina, Kolombia, Kuba, Ghana, Haiti, India, Panama,dan Peru. Pengunaan Momordica charantia yang paling umum pada negara-negara tersebut adalah sebagai obat penyakit diabetes, jantung dan sakit perut. Di daerah tropis Momordica charantia digunakan sebagai pengobatan luka, obat luar maupun diminum untuk menghindari infeksi dari cacing dan parasit.

Dengan berbagai khasiatnya banyak penelitian ilmiah yang mengkaji buah pahit ini dari aspek farmakologisnya, tumbuhan ini juga telah dikaji secara intensif dari aspek fitokimianya. Momordica charantia mengandung senyawa metabolit sekunder diantaranya adalah senyawa metabolit sekunder turunan terpenoid, floavonoid dan steroid. Senyawa-senyawa metabolit sekunder tersebut berupa glikosida ataupun aglikon. Selain senyawa metabolik sekunder momordica charantia pun mengandung senyawa fenolik seperti polifenol; senyawa asam lemak yaitu asam butirat, asam palmitat, asam linoleat dan asam stearat; serta mengandung protein.

II.    POKOK PEMBAHASAN

A.       Isolasi Bioaktif / Metabolit Sekunder

B.       Pemurniaan / Purification

C.       Elusidasi / Penentuan Struktur

D.       Uji Bioaktifitas

III. PEMBAHASAN

A.       Isolasi Bioaktif / Metabolit Sekunder

Untuk mengisolasi suatu senyawa kimia yang berasal dari bahan alam hayati pada dasarnya menggunakan metode yang sangat bervariasi, seperti yang diaplikasikan dalam proses industri. Metode pengempaan digunakan pada senyawa katecin dari daun gambir juga isolasi CPO dari buah kelapa sawit.

Metode ini umum digunakan karena senyawa organik yang diperoleh dengan kuantitas yang cukup banyak. Tetapi berbeda dengan senyawa bahan alam hasil proses metabolit sekunder lainnya yang pada umumnya dengan kandungan yang relatif kecil, maka metode-metode dalam proses industri tersebut tidak dapat digunakan.

Berdasarkan hal diatas maka metode yang umum dalam isolasi senyawa metabolit sekunder dapat digunakan. Metode standar laboratorium dengan kuantitas sampel terbatas dan perlunya menentukan metode yang paling sesuai dengan maksud tersebut.

Dari identifikasi awal, maka dapat diamati kandungan senyawa dari tumbuhan sehingga untuk isolasi dapat diarahkan pada suatu senyawa yang lebih dominan dan salah satu usaha mengefektifkan isolasi senyawa tertentu maka dapat dimanfaatkan pemilihan pelarut organik yang akan digunakan pada isolasi tersebut, dimana pelarut polar akan lebih mudah melarutkan senyawa polar dan sebaliknya senyawa non polar lebih mudah larut dalam pelarut non polar.[1]

1.        Identifikasi Kandungan Kimia

Sebelum melakukan isolasi terhadap suatu senyawa kimia yang diinginkan dalam suatu tumbuhan maka perlu dilakukan identifikasi pendahuluan kandungan senyawa metabolit sekunder yang ada pada masing-masing tumbuhan, sehingga dapat diketahui kandungan senyawa yang ada secara kualitatif dan mungkin juga secara kuantitatif golongan senyawa yang dikandung oleh tumbuhan tersebut. untuk tujuan tersebut maka diperlukan metoda persiapan sampel dan metoda identifikasi pendahuluan dari senyawa metabolit sekunder, yaitu untuk mengetahui adanya Senyawa Alkaloid dan Senyawa Terpenoid, steroid, fenolik, flavonoid dan saponin.

2.        Ekstraksi dan fraksinasi

Secara umum ekstraksi senyawa metabolit sekunder dari seluruh bagian tunbuhan seperti bunga, buah, daun, kulit batang dan akar menggunakan sistem maserasi menggunakan pelarut organik polar seperti metanol. Beberapa metode ekstraksi senyawa organik bahan alam yang umum digunakan antara lain: Maserasi, Perkolasi, Sokletasi, Destilasi Uap, Pengempaan.

Buah pare dipisahkan dari biji dan dikeringkan, kemudian diblender menjadi serbuk, diekstrak menggunakan pelarut methanol sebanyak 3X1 liter, kemudian filtrate disaring menggunakan corong Buchner, lalu dipekatkan menjadi setengah volume awal. Ekstrak methanol yang telah dipekatkan difraksinasi berturut-turut dengan heksan 3X50 mL dan etil asetat 3x10 mL setiap kali kali ekstraksi.

Sehingga diperoleh fraksi heksan etil asetat dan methanol sisa. Masing-masing fraksi dipekatkan menggunakan alat rotary evaporator. Dari tahap fraksinasi tersebut diperoleh fraksi heksan (4,1 gram; 8,2%), fraksi etil asetat (54 gram; 42,9 %), dan fraksi methanol-air (18 gram; 36%).[2]

B.       Pemurniaan / Purification

Proses pemisahan dan pemurnian bertujuan untuk mendapatkan senyawa murni dari fraksi yang ada. Dimana dalam hal ini difokuskan pada pemisahan dan pemurnian fraksi senyawa n-heksana saja.  Dalam proses pemisahan dan pemurnian ini di lakukan dengan metode kromatografi kolom tetapi sebelum analisis dilakukan, terlebih dahulu analisis dilakukan dengan kromatografi lapis tipis.

Pemisahan pertama dilakukan dengan menggunakan KVC, pelarut yang digunakan merupakan pelarut organik yang ditingkatkan kepolarannya secara gradien. Pada pemisahan ini digunakan pelarut n-heksan dan etil asetat. Berdasarkan analisa kromatogram KLT fraksi heksana pada eluen heksana dan etil asetat dengan beberapa komposisi perbandingan maka KVC dilakukan dengan beberapa perbandingan yaitu 100% n-heksan sebanyak 2 kali :24:1 sebanyak 3 kali : 21 : 4 sebanyak 4 kali ; 18:7 sebanyak 2 kali; 15 :10 sebanyak 2 kali ; 9:16 sebanyak 2 kali; 6:19 sebanyak 2 kali; 3:22 sebanyak 2 kali dan 100% asetat sebanyak 2 kali dengan volume 50 mL setiap kali elusi. KVC fraksi heksan dengan massa 4,1 gram menghasilkan 22 fraksi.

Fraksi yang memiliki pola kromatogram yang sama digabungkan hingga mendapatkan 5 fraksi gabungan. Massa dari masing-masing fraksi tersebut adalah fraksi A (1-4) sebanyak 838 mg, fraksi B (5) sebanyak 1.082 mg, fraksi C (6-7) sebanyak 1.017 mg, fraksi D dan E (8-17) sebanyak 82 mg dan fraksi F (128-22) sebanyak 91 mg. Fraksi-fraksi gabungan dianalisis dengan KLT menggunakan eluen heksana : etil asetat dengan perbandingan 6 : 4.

Analisa kromatogram 24 fraksi yang diperoleh dari hasil KVC dapat digabungkan berdasarkan kesamaan Rf menjadi 8 fraksi. Massa masing-masing fraksi tersebut adalah fraksi C1 (1-6) sebanyak 15 mg, C7 (7) sebanyak 15 mg, C2 (8-10) sebanyak 126 mg, C11 ( 11)sebanyak 117 mg, C3 (12-14) sebanyak 149 mg, C4 (15-19) sebanyak 188 mg, C20 (20) sebanyak 59 mg dan C5 (21-24) sebanyak 207 mg.

Hasil penggabungan fraksi dalam C2 dan C11 berbentuk kristal. Rekristalisasi dilakukan dengan melarutkan fraksi kristal dengan metanol panas yang kemudian didinginkan. Setelah didinginkan terbentuk kristal yang tidak larut di dialam metanol. Kristal tersebut dipisahkan dengan menggunkan kertas saring. Dengan menggunakan teknik pemurnian rekristalisasi pada kedua difraksi tersebut didapat beberapa fraksi kristal. Fraksi- fraksi  tersebut diuji kemurniannya dengan KLT dan dilihat pula kromtogramnya untuk mengetahui senyawa yang sama atau tidak pada hasil kemurnian dengan rekristalisasi tersebut. Dari fraksi-fraksi hasil diperoleh fraksi murni yakni C2 – 1 dan C11-2. Hasil rekritalisasi kedua fraksi tersebut kemudian dianalisis dengan menggunakan FT-IR dan NMR.[3]

 

C.       Elusidasi / Penentuan Struktur

1.      Penentuan Sruktur Senyawa

-          Analisis Spektrum IR

Pada fraksi C2-1, spectrum IR yang dihasilkan menunjukkan adanya pita serapan gugus fungsi OH pada bilang gelombang 3423,4 cm^-1 ; vibrasi ulur C-H sp³ pada bilangan gelombang 2933,5 cm^-1 dan 2852,5 cm^-1 ; C=C pada bilangan gelombang 1627,9 cm^-1 ; vibrasi tekuk CH₃ pada bilangan gelombang 1449,4 cm^-1. Bilangan gelombang tersebut menunjukkan bahwa senyawa pada fraksi C2^-1 merupakan senyawa alifatik.

Pada fraksi C11-2, spectrum IR yang dihasilkan menunjukkan adanya pita serapan gugus fungsi OH pada bilang gelombang 3433,1 cm^-1 ; vibrasi ulur C-H sp³ pada bilangan gelombang 2922,0 cm^-1 dan 2852,5 cm^-1 ; C=C pada bilangan gelombang 1627,8 cm^-1 ; vibrasi tekuk CH₃ pada bilangan gelombang 1382,9 cm^-1 ; C-O pada bilangan gelombang 1041,5 cm^-1. Bilangan gelombang tersebut menunjukkan bahwa senyawa pada fraksi C11-2 merupakan senyawa alifatik dan tidak terglukasi karena tidak menunjukkan adanya pelebaran puncak OH yang menandakan senyawa yang terglukasi.

Dari hasil pengukuran IR pada kedua fraksi, dapat diduga kedua fraksi terdapat senyawa yang sama, berdasarkan spectrum pada kedua senyawa terdapat gugus-gugus yang sama dengan hal ini menunjukkan kedua fraksi memiliki pola kromatogram yang mirip.

-          Analisis Spektrum NMR

Analisis spectrum NMR ¹H

Analisis spectrum NMR ¹H terhadap fraksi  C11-2 dan C2-1 dilakukan untuk mengetahui gambaran berbagai jenis atom hydrogen dalam molekul. Spectrum NMR ¹H senyawa dari fraksi C2-1 dan C11-2 memperlihatkan pada geseran 0,51-2,27 ppm merupakan sinyal untuk H yang terikat dengan karbon sp³. Pada geseran sekitar 3,34 ppm merupakan sinyal untuk H yang terikat dengan C heteroatom atau lebih spesifik dengan C metoksil (C-O). dan pada geseran 4,63-5,15 ppm merupakan sinyal untuk H yang terikat dengan C ikatan rangkap. Dari spectrum ini dapat disimpulkan bahwa senyawa yang berhasil di isolasi merupakan senyawa alifatik dengan ikatan rangkap, memilki ikatan heteroatom, dan tidak memilkii gugus karbonil.

Analisis Spektrum NMR ¹³C

Analisis spectrum NMR ¹³C dimaksudkan untuk menentukan kerangka karbon yang dimilki oleh senyawa. Pada spectrum ini dapat diketahui jumlah karbon dan jenis karbonnya (metal, metilen, metin, atau karbon quartener).

Spectrum NMR ¹³C Decopling

Spectrum ini menunjukkan seluruh karbon yang terdapat di senyawa dengan menghilangkan pengaruh atom tetangga (decopling) akan tetapi pada spectrum ini tidaka ada pembeda untuk jenis karbonnya. Pada pengukuran NMR ¹³C terlihat geseran spectrum dimulai dari geseran 11,8-147,70. Perhitungan jumlah karbon berdasarkan analisis spekrum ini didapat jumlah karbon senyawa pada fraksi C2-1 adalah 30.[4]

 

D.       Uji Bioaktifitas

Dipermukaan bumi ini terdapat ratusan ribu spesies yang masing-masing berpotensi mengandung metabolit sekunder yang unik. Dengan demikian jumlah senyawa metabolit sekunder pun menjadi sangat banyak. Di antaranya ada yang mempunyai aktifitas biologis dan ada pula yang tidak aktif biologis.  

Untuk penapisan senyawa berkhasiat dari sumber alam maupun dari bahansintetik  yang jumlahnya ribuan diperlukan suatu metode penapisan yang cepat dan akurat. Untuk mempersempit jumlah bahan yang akan ditapis secara bioassay bisa juga dilakukan penapisan etnofarmasi terlebih dahulu. Dalam hal ini bahan yang akan diuji hanyalah yang secara tradisional digunakan oleh masyarakat sebagai obat. 

Penemuan bahan berkhasiat dari bahan alam maupun dari perpustakaan senyawa yang dihasilkan dari program "Combinatorial Chemistry" memerlukan teknologi penapisan senyawa khasiat dan teknologi isolasi dengan tuntunan uji bioekatifitas. Bioassay bisa dilakukan in vivo maupun in vitro. Tetapi untuk penapisan senyawa dengan aktifitas tertentu diperlukan suatu bioassay yang sederhana dan cepat sehingga dapat menapis banyak senyawa dalam waktu yang lama dan tidak memerlukan banyak biaya. Untuk penapisan bahan khasiat, dilakukan dengan dua kelompok assay yaitu selular dan molekular assay. Uji bioaktifitas selular menggunakan sel utuh dengan target random yaitu apa saja yang menghambat pertumbuhan sel. Sedangkan uji bioaktifitas molekuler menggunakan sistem terisolasi seperti enzim, reseptor, DNA dan lain-lain dengan target subseluler tunggal.

Dalam hal ini bioassay terhadap senyawa bahan alam dilakukan dengan mengukur daya hambat senyawa terhadap aktifitas enzim farnesil transperase. Prosedur  bioassay dari senyawa alam maupun sintetis sangat tergantung pada aktifitas biologis apa yang dicari atau ditapis dari perpustakaan senyawa yang ada.   Bioassay sangat murah, mudah dan cepat merupakan pilihan untuk menapis senyawa bahan alam, baik penapisan esktrak kasar maupun dalam penapisan fraksi-fraksi sewaktu isolasi, diantaranya adalah : 

1.      Aktivitas racun terhadap ikan (Piscidal Activity). Salah satu bioassay berdasarkan brine shrimp bioassay. Tumbuhan yang mempunyai aktititas racun bagi ikan juga ditemukaan mempunyai aktifitas lain seperti insektisida,  inhibitor pertumbuhan tumbuhan, co-karsinogen atau irritant. Dalam hal ini, aktifitas piscidal merupakan marker yang berguna untuk bioaktifitas lainnya.

2.       Aktifitas untuk menghambat pertumbuhaaan mikroba seperti pada uji antimikroba dan anti jamur. Bioassay untuk anti mikroba dapat dilakukan dengan menguji daya hambat pertumbuhan mikroba dalam medium padat oleh senyawa yang diuji dan menguji daya hambat senyawa uji terhadap enzim  yang berfungsi dalam sintesis protein, DNA atau dinding sel. Metoda yang  paling sederhana adalah dengan melakukan uji daya hambat senyawa uji terhadap pertumbuhan mikroba tersebut pada medium padat.

3.      Uji Antifeedant untuk mendeteksi dan mengisolasi senyawa metabolit sekunder tumbuhan yang bersifat aktif biologis terhadap Serangga. ekstrak tumbuhan yang diuji ditambahkan kedalam makanan serangga, kemudian beberapa jenis serangga uji diberi makan dengan diet yang telah dicampur dengan ekstrak uji dan kemudian serangga tersebut dianalisa.[5]

IV. KESIMPULAN

Hasil penelitian, isolasi dan karakterisasai senyawa turunan terpenoid dari fraksi n-heksan Momordica charantia diperoleh senyawa murni yaitu fraksi C2-1 (24 mg) dan C11-2 (9 mg), yang memiliki karakter antara lain yaitu merupakan senyawa alifatik yang memiliki ikatan rangkap (C=C) dan memiliki gugus OH. Dengan membandingkan data antara hasil pengukuran dan pendekatan etnobotani, senyawa yang berhasil diisolasi tersebut memiliki jenis kerangka triterpen aglikon kukurbitan yang tidak memiliki gugus karbonil.

PERMASALAHAN:

Dari hasil isolasi senyawa turunan terpenoid dari Fraksi n-Heksan (Momordica charantia) pada artikel di atas dinyatakan bahwa senyawa yang berhasil diisolasi tersebut memiliki jenis kerangka triterpen aglikon kukurbitan yang tidak memiliki gugus karbonil. Yang menjadi permasalahannya, mengapa bisa diperoleh senyawa yang tidak memiliki gugus karbonil. Sedangkan terpenoid itu sendiri tersusun atas gugus-gugus hidroksil, karbonil serta gugus fungsi lainnya?